Proteingehaltsanalytik von Biologika

Proteingehaltsanalytik: Methoden, Eignung und Grenzen

Die Bestimmung des Proteingehalts zählt zu den zentralen analytischen Aufgaben in der Qualitätskontrolle sowie in Forschung und Entwicklung proteinbasierter Produkte. Ob monoklonale Antikörper, rekombinante Proteine, Enzyme oder andere proteinbasierte Arzneimittel, eine zuverlässige und reproduzierbare Quantifizierung ist entscheidend für die Bewertung von Produktqualität, Dosierung, Stabilität, Prozesskonsistenz und Chargenvergleichbarkeit. Darüber hinaus dient die Proteinkonzentration häufig als Ausgangspunkt für weiterführende Charakterisierungs- und Freigabeuntersuchungen.

HWI setzt daher ein breites Spektrum etablierter und moderner Verfahren zur Proteinquantifizierung ein. Abhängig von Probenart und Fragestellung bestimmen wir entweder den Gesamtproteingehalt einer Probe oder die Konzentration eines spezifischen Zielproteins. Die Auswahl der geeigneten Methode erfolgt individuell und berücksichtigt sowohl die Probenmatrix als auch die geforderte Sensitivität, Selektivität und regulatorische Anforderung.

Kalorimetrische Methoden

Zu den etablierten kalorimetrischen Verfahren der Proteingehaltsbestimmung zählen die Biuret-Methode, der Lowry-Assay, der Bradford-Assay sowie der BCA-Assay. Allen Verfahren gemeinsam ist, dass sie eine Farbreaktion nutzen, deren Intensität proportional zur vorhandenen Proteinmenge ist.
Die Biuret-Methode zählt zu den ältesten Verfahren zur Proteinquantifizierung. Sie basiert auf der Komplexbildung zwischen Kupferionen und Peptidbindungen unter alkalischen Bedingungen. Die Methode ist robust und einfach durchzuführen, weist jedoch eine vergleichsweise geringe Empfindlichkeit auf und wird heute häufig durch sensitivere Verfahren ergänzt.

Eine Weiterentwicklung stellt der Lowry-Assay dar. Er kombiniert die Biuret-Reaktion mit einer zusätzlichen Redoxreaktion unter Verwendung des Folin-Ciocalteu-Reagenzes. Dadurch erreicht die Methode eine deutlich höhere Empfindlichkeit, ist jedoch gleichzeitig anfälliger gegenüber Matrixeffekten und störenden Begleitstoffen.
Zu den am häufigsten eingesetzten Verfahren gehört heute der Bradford-Assay, der auch im Rahmen der mikroplattenbasierten Analytik bei der HWI eingesetzt wird. Dabei bindet Coomassie-Brilliant-Blue an Proteinstrukturen und erzeugt eine messbare Farbänderung, die proportional zur Proteinmenge ist. Der Bradford-Assay überzeugt durch seine hohe Sensitivität, einfache Handhabung und seine Eignung für Hochdurchsatzanwendungen. Im Mikroplattenformat lassen sich zahlreiche Proben parallel analysieren, was ihn zu einem etablierten Werkzeug in der Routineanalytik und Qualitätskontrolle macht.

Für Proben mit höherer Matrixkomplexität stellt der BCA-Assay eine robuste Alternative dar. Er basiert auf der Reduktion von Kupferionen durch Proteine und einer anschließenden Farbreaktion mit Bicinchoninsäure. Der Assay zeichnet sich durch lineare und präzise Ergebnisse aus und ist gegenüber vielen Detergenzien toleranter als der Bradford-Assay. Auch hier ermöglicht das Mikroplattenformat eine effiziente Bearbeitung großer Probenzahlen bei gleichzeitig reduziertem Probenverbrauch.

Fluoreszenzbasierte Methoden

Neben kalorimetrischen Verfahren kommen auch fluoreszenzbasierte Assays zur Proteinquantifizierung zum Einsatz. Diese zeichnen sich häufig durch eine höhere Empfindlichkeit aus und eignen sich insbesondere für niedrige Proteinkonzentrationen. Zu den bekanntesten Vertretern zählen NanoOrange®, Qubit™ Protein Assays und weitere Farbstoff-basierte Fluoreszenzverfahren.

Bei der HWI kommt unter anderem der NanoOrange®-Assay zum Einsatz. Die verwendeten Reagenzien zeigen in wässriger Lösung nahezu keine Eigenfluoreszenz und entwickeln erst nach Bindung an Proteinstrukturen ein starkes Fluoreszenzsignal. Dadurch lassen sich sehr niedrige Proteinmengen hochsensitiv quantifizieren. Zudem weist der NanoOrange-Assay eine geringere Abhängigkeit von der Proteinzusammensetzung auf und ist weniger anfällig gegenüber störenden Begleitstoffen wie Nukleinsäuren. In Kombination mit Mikroplatten-Readern ermöglicht er präzise Analysen bei minimalem Probenvolumen und eignet sich insbesondere für anspruchsvolle quantitative Fragestellungen.

UV-basierte Methoden

Eine der direktesten Methoden stellt die UV‑Absorption bei 280 nm dar. Proteine absorbieren in diesem Wellenlängenbereich das Licht primär aufgrund der aromatischen Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin, in geringen Maßen auch durch Phenylalanin und Disulfidbrücken. Die Methode eignet sich insbesondere für gereinigte und gut charakterisierte Proteine und zeichnet sich durch ihre schnelle Durchführung sowie den Verzicht auf zusätzliche Reagenzien aus. Da das Signal von der Anzahl aromatischer Aminosäuren abhängt, handelt es sich jedoch nicht um eine klassische Bestimmung des Gesamtproteingehalts (Total Protein Content), sondern vielmehr um eine Konzentrationsbestimmung definierter und hinsichtlich ihres Extinktionsverhaltens bekannter Proteine.

Eine moderne Weiterentwicklung dieses Ansatzes ist die soloVPE®‑Technologie, die ebenfalls auf UV‑Absorption basiert, jedoch mit einer variablen optischen Weglänge arbeitet. Dadurch können auch hochkonzentrierte Proteinproben häufig direkt und ohne zusätzliche Verdünnung quantifiziert werden. Dies reduziert potenzielle Verdünnungsfehler. Einschränkend wirken bei UV‑basierten Verfahren mögliche Störstoffe in der Probe sowie die Abhängigkeit vom jeweiligen Aminosäureprofil, weshalb sie für komplexe Matrizes oder heterogene Proteingemische nur eingeschränkt geeignet sind.

Chromatographische und massenspektrometrische Methoden

Eine besondere Stellung unter den chromatographischen Verfahren nimmt die Aminosäureanalyse (AAA) ein. Hierbei wird das Protein zunächst vollständig hydrolysiert. Die freigesetzten Aminosäuren werden anschließend chromatographisch getrennt, quantifiziert und zur Berechnung der ursprünglichen Proteinmenge herangezogen. Aufgrund ihrer hohen Genauigkeit und Rückführbarkeit gilt die Aminosäureanalyse als Referenzmethode für die Konzentrationsbestimmung von Proteinen und monoklonalen Antikörpern. Sie wird insbesondere im biopharmazeutischen Umfeld häufig zur Verifizierung oder Kalibrierung anderer Quantifizierungsmethoden eingesetzt und ist als geeignete Methode in der ICH-Q6B-Guideline beschrieben. Im Vergleich zu Assay-basierten oder UV-basierten Verfahren ist die Aminosäureanalyse jedoch deutlich zeit- und arbeitsintensiver und wird daher vor allem für Referenz- und Charakterisierungszwecke eingesetzt.

Darüber hinaus kommen chromatographische Verfahren wie die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) zur Quantifizierung bestimmter rekombinanter Proteine sowie Größenausschlusschromatographie mit UV-Detektion (SEC-UV) oder Größenausschlusschromatographie gekoppelt mit Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS) zur Untersuchung von Proteinaggregaten und hochmolekularen Spezies zum Einsatz. Diese Verfahren ermöglichen die Quantifizierung spezifischer Proteine sowie Aussagen zu qualitätsrelevanten Eigenschaften wie Reinheit, Monomergehalt und Aggregatbildung. Im Gegensatz zu klassischen Protein-Assays steht dabei nicht die Bestimmung des Gesamtproteingehalts, sondern die Charakterisierung definierter Proteinspezies im Vordergrund.

Für eine weiterführende strukturelle Charakterisierung reichen chromatographische Informationen allein jedoch häufig nicht aus. Hier kommen massenspektrometrische Verfahren zum Einsatz. Während die Intact-Mass-Analyse die Bestimmung der Molekülmasse intakter Proteine und eine erste Beurteilung von Produktheterogenitäten ermöglicht, dienen LC‑MS/MS‑Verfahren insbesondere der Identifizierung von Proteinen und Peptiden sowie der Charakterisierung posttranslationaler Modifikationen. Darüber hinaus können detaillierte Reinheits‑ und Heterogenitätsprofile erstellt sowie produktbezogene Varianten untersucht werden. Gerade bei komplexen Biologika sind massenspektrometrische Verfahren unverzichtbare Werkzeuge zur strukturellen Charakterisierung und Qualitätsbewertung. LC‑MS/MS‑basierte Verfahren umfassen unterschiedliche Akquisitionsstrategien mit jeweils unterschiedlichen Zielsetzungen. Verfahren wie das Multiple Reaction Monitoring (MRM) ermöglichen die hochspezifische Quantifizierung einzelner Proteine oder definierter Proteinmarker. Dagegen eignen sich Ansätze wie Data Dependent Acquisition (DDA) oder Data Independent Acquisition (DIA) zusätzlich zur Identifizierung von Proteinen sowie zur Untersuchung struktureller Merkmale und Modifikationen.

Immunologische Methoden

Für die hochsensitive Bestimmung spezifischer Proteine werden häufig immunologische Verfahren wie der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) eingesetzt. Die Detektion erfolgt über spezifische Antikörper und ermöglicht die Quantifizierung von Zielproteinen selbst in komplexen Matrizes und bei sehr niedrigen Konzentrationen. Hierbei wird auch nicht der Gesamtproteingehalt bestimmt, sondern gezielt ein einzelnes Protein nachgewiesen und quantifiziert.

Analytische Einordnung

Die beschriebenen Verfahren liefern unterschiedliche Informationen über eine Probe. Kolorimetrische und fluoreszenzbasierte Assays werden häufig zur Bestimmung des Gesamtproteingehalts bzw. der Gesamtproteinmenge eingesetzt. UV-basierte Verfahren (z. B. A280) ermöglichen hingegen eine direkte Konzentrationsbestimmung gereinigter und charakterisierter Proteine, sofern deren Extinktionskoeffizient bekannt ist und störende Matrixkomponenten weitgehend fehlen.
Chromatographische Verfahren liefern je nach Detektionsprinzip unterschiedliche Informationen über Proteine. Während die Aminosäureanalyse als Referenzmethode eine besonders genaue und rückführbare Bestimmung des absoluten Proteingehalts ermöglicht, werden RP-HPLC und SEC-UV häufig zur Quantifizierung, Reinheitsbestimmung sowie zur Detektion von Abbauprodukten und Aggregaten eingesetzt. SEC-MALS ermöglicht darüber hinaus die Bestimmung der absoluten Molekülmasse und die Charakterisierung von Aggregaten. Massenspektrometrische Verfahren liefern zusätzliche Informationen zur Identität, Sequenz und Struktur von Proteinen, während immunologische Methoden insbesondere für den sensitiven und selektiven Nachweis sowie die Konzentrationsbestimmung spezifischer Zielproteine genutzt werden.
Keine einzelne Methode kann jedoch alle analytischen Fragestellungen gleichzeitig beantworten. Die Wahl der geeigneten Methode hängt daher stets von Probenart, Fragestellung, erforderlicher Sensitivität sowie regulatorischen Anforderungen ab.

Fazit

Die Proteinquantifizierung umfasst ein breites Spektrum analytischer Verfahren, von klassischen kalorimetrischen Assays über fluoreszenz- und UV-basierte Methoden bis hin zu chromatographischen, massenspektrometrischen und immunologischen Ansätzen. Die Auswahl der geeigneten Methode richtet sich nach der jeweiligen analytischen Fragestellung sowie den Anforderungen an Genauigkeit, Selektivität und Informationsgehalt.

Während Protein-Assays und UV-basierte Verfahren eine schnelle und effiziente Quantifizierung ermöglichen, erfordert die umfassende Charakterisierung von Biologika, Biosimilars und Antibody-Drug Conjugates den Einsatz zusätzlicher orthogonaler Methoden Erst die Kombination komplementärer analytischer Techniken ermöglicht eine fundierte Bewertung von Qualität moderner biopharmazeutischer Produkte wie Identität, Stabilität, Reinheit und Struktur.

Wir unterstützen Sie gerne mit unseren Labordienstleistungen und bieten umfassende Services im Bereich Analytik von Biologika.