Vergleich verschiedener Analyseverfahren

Vergleich verschiedener Verfahren zur Untersuchung von monoklonalen Antikörpern

Für den Einsatz als Therapeutika erfordern die pharmazeutischen Produkte nach verschiedenen Produktionsverfahren, z. B. der Herstellung in transgenen Organismen wie Bakterien oder Zellkulturen und der anschließenden Isolierung und Reinigung, eine geeignete Qualitätskontrolle. Im Zusammenhang mit der Prüfung von monoklonalen Antikörpern ist hierfür beispielsweise die Überprüfung der Identität, Reinheit und Integrität der Produkte von entscheidender Bedeutung. Denn mögliche Verunreinigungen wie andere Proteine, Zellbestandteile oder Abbauprodukte können die Aktivität, Wirksamkeit, Sicherheit sowie die pharmakokinetischen Eigenschaften von Antikörpern beeinträchtigen.(1),(2)

Abbildung 1: Das Elektropherogramm von IgG (2 µg/µL), aufgenommen mit dem Agilent Protein 230 Kit unter nicht-reduzierten Bedingungen. Zu erkennen sind IgG intakt bei 160.2 kDa und die einzelnen Fragmente des Antikörpers: light chain (LC) bei 27,1 kDa und heavy chain (HC) bei 56,4 kDa. Die Signale mit den Nummern 3-6 weisen auf Halb-Antikörper-Fragmente und Dimere bzw. weitere Aggregate.

In Kombination mit einer spezifischen Probenvorbereitung (z. B. reduziert vs. nicht reduziert, deglykosyliert vs. glykosyliert) ermöglichen einige Analysemethoden die Untersuchung einer Vielzahl von Eigenschaften und der Qualität von Antikörpern. Zur Untersuchung der Qualitätsmerkmale von Antikörpern stehen verschiedene Techniken zur Verfügung, z. B. Kapillarelektrophorese (CE), SDS-PAGE, UV-HPLC oder LC-MS. Im Rahmen dieses Blogbeitrags werden solche Analysentechniken wie mikrochip-basierter SDS-PAGE (2100 BioAnalyzer der Firma Agilent) und RP-HPLC mit UV (ACQUITY Premier System der Firma Waters) näher vorgestellt.

Bei der Analyse intakter Monomere mittels mikrochipbasierter SDS-PAGE können weitere Polypeptid-Einheiten wie die schwere Kette, leichte Kette, Dimere oder glykosylierte und nicht-glykosylierte Formen der Antikörper als Verunreinigungen detektiert werden. Die Elektropherogramme weisen eine ausgezeichnete Auflösung zwischen den Signalen auf und ermöglichen somit eine Qualitätsprüfung der Proben. Eine genauere Bestimmung der Größe von kleineren Fragmenten ist mit dem P230-Kit und von größeren Fragmenten mit dem HSP250-Kit möglich. Nun deuten die Signale auf mehrere unterschiedlichen Fragmente und Aggregate hin. Für eine präzisere Qualitätskontrolle der Proben sind jedoch orthogonale Analyseverfahren, wie zum Beispiel RP-HPLC mit UV oder LC-MS, erforderlich.

Ein ACQUITY Premier System, entwickelt für den Einsatz in biowissenschaftlichen und biopharmazeutischen Studien und optimiert für die Biomolekülanalyse, kann als LC-System für Proteinanalysen eingesetzt werden. Polyetheretherketon (PEEK) wird in diesem System anstelle des üblichen Edelstahls für Kapillaren verwendet. Dieser Kunststoff ist mechanisch stabil, chemisch inert und hydrophob, wodurch bessere Peakformen und höhere Wiederfindungsraten bei der Analyse erzielt werden können. Eine hohe Trennleistung, die eine genaue Qualitätskontrolle ermöglicht, kann durch den Einsatz verschiedener stationärer Phasen, optimierter chromatographischer Parameter oder verschiedene Detektionsarten erreicht werden.

Abbildung 2: Das Chromatogramm der IgA-Probe unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Phenyl-Säule (2.1 x 150 mm, 5 µm, 1000 Ǻ); A: Wasser + 0.1 % TFA, B: ACN + 0.1 % TFA; 0.4 ml / min; 80 °C; 210 nm. Die Signale mit den Nummern 1-3 weisen auf Antikörper mit unterschiedlicher Glykanstruktur oder unterschiedlichem Glykosylierungsgrad hin.

Abbildung 3: Das Chromatogramm der IgA-Probe unter reduzierenden Bedingungen. Phenyl-Säule (2.1 x 150 mm, 5 µm, 1000 Ǻ); A: Wasser + 0.1 % TFA, B: ACN + 0.1 % TFA; 0.4 ml / min; 80 °C; 280 nm. Die Signale weisen auf light chain (LC) und heavy chain (HC).

Antikörper unterliegen während der Herstellung posttranslationalen Modifikationen. Die Modifikationen und der Grad der Modifikationen können aufgrund geringfügiger Änderungen der Produktionsbedingungen wie der Pufferzusammensetzung, des pH-Werts oder der Temperatur variieren. Insbesondere die Glykane haben einen signifikanten Einfluss auf die Kinetik und Stabilität der Antikörperstruktur. Das Glykosylierungsmuster der verschiedenen Zucker ist wichtig für die Erkennung des Antikörpers durch das Immunsystem. Therapeutische Antikörper mit einem falschen Glykosylierungsmuster können vom Immunsystem als fremd erkannt werden. Dies kann einerseits die Wirkung blockieren und andererseits schwerwiegendere Reaktion des Immunsystems hervorrufen. Daher sind Methoden zur Analyse der Glykanstruktur von großer Bedeutung. Glykane, die durch PNFase gespalten und geladen werden, können zum Beispiel durch UHPLC, gekoppelt mit Fluoreszenz-Detektion und hochauflösender Massenspektrometrie, detektiert werden. Weitere mögliche Antikörper-Modifikationen umfassen beispielsweise Oxidationen oder Methylierungen einzelner Aminosäuren, Umwandlungen des N-terminalen Glutamins sowie das Fehlen des C-terminalen Lysins durch die Wirkung von Carboxypeptidasen.^2,3 Die beschriebenen Modifikationen tragen auch zur Heterogenität der therapeutischen Antikörper bei und können durch hochauflösende massenspektrometrische Analysen charakterisiert werden.

Die Microchip-Gelelektrophorese und die RP-HPLC sind zwei zueinander orthogonale analytische Methoden, die sich gut für die Analyse von Proteinen eignen. Soll die Identität und Reinheit der Antikörper bestimmt werden, bietet die Microchip-Gelelektrophorese im Vergleich zur RP-HPLC eine deutlich verbesserte Auflösung sowie automatisierte Größenbestimmung. Darüber hinaus bietet die Microchip-Technologie eine signifikant höhere Empfindlichkeit, die es ermöglicht, Fragmente im Bereich von pg/µl nachzuweisen. Bei den Untersuchungen mittels RP-HPLC konnten im µg/µl-Bereich nur manche der Fragmente und Aggregate detektiert werden. Ein weiterer Vorteil der mikrochip-basierten Gelelektrophorese gegenüber der RP-HPLC ist die Geschwindigkeit der Analyse. Hier können einzelne Proben meist bereits mit sehr kurzen Laufzeiten (< 1 min) untersucht werden, während die getesteten HPLC-Methoden Laufzeiten von 3-15 min aufwiesen. Abhängig von der analytischen Fragestellung und dem verfügbaren HPLC-System sind in der Regel Laufzeiten von 60 Minuten oder länger notwendig. Die Microchip-Gelelektrophorese hat jedoch auch Limitierungen. Für eine mikrochip-basierte Gelelektrophoreseanalyse können nur vorgefertigte Kits verwendet werden. Es gibt Kits für einen bestimmten Proteinmolekularbereich (5-230 kDa oder 10-250 kDa). Ein weiterer Nachteil der mikrochip-basierten Gelelektrophorese ist, dass die Probenvorbereitung komplex sein kann und eine Derivatisierung erfordert. Weitere Informationen dazu finden Sie im Blog „Gel-Elektrophorese in der Qualitätskontrolle von Biopharmazeutika“. Im Gegensatz zur mikrochip-basierten Gelelektrophorese sind chromatographische Techniken wie die HPLC sehr flexibel. Die Trenneffizienz kann durch viele Parameter beeinflusst werden, z.B. durch die Zusammensetzung der mobilen Phase oder durch verschiedene chemische Eigenschaften der stationären Phase. Darüber hinaus ermöglicht die HPLC den Einsatz verschiedenster Detektionsmethoden wie PDA, UV, RI, CAD oder gekoppeltes hochauflösendes MS.

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1. World Health Organisation. WHO-Guideline for Safe Production and Quality Control of Monoclonal Anibodies for Use in Humans; 2021.
2. Wang, W. H.; Cheung-Lau, J.; Chen, Y.; Lewis, M.; Tang, Q. M. Specific and High-Resolution Identification of Monoclonal Antibody Fragments Detected by Capillary Electrophoresis–Sodium Dodecyl Sulfate Using Reversed-Phase HPLC with Top-down Mass Spectrometry Analysis. MAbs 2019, 11 (7), 1233–1244. https://doi.org/10.1080/19420862.2019.1646554.
3. Huhn, C.; Selman, M. H. J.; Ruhaak, L. R.; Deelder, A. M.; Wuhrer, M. IgG Glycosylation Analysis. Proteomics. February 2009, pp 882–913. https://doi.org/10.1002/pmic.200800715