Qualitätskontrolle von Biopharmazeutika mit Mikroplatten-Reader

Die vielfältigen Einsatzmöglichkeiten von Mikroplatten-Reader in der Qualitätskontrolle von Biopharmazeutika

Mikroplatten-Reader sind seit mehreren Jahrzenten gängige Labormessinstrumente und in der Forschung, Entwicklung und Qualitätskontrolle von Biopharmazeutika nicht mehr wegzudenken. (1) Die riesige Auswahl an erhältlichen Analyse-Kits ermöglicht einen breiten und flexiblen Einsatz für die Messung von biologischen, chemischen und physikalischen Reaktionen in Mikroplatten. Das Anwendungsspektrum umfasst neben Protein-, Nukleinsäuren- und Endotoxinquantifizierungen auch ELISA- und Interaktionsassays. Gegenüber der Messung in Küvetten bieten Mikroplatten-Reader erhebliche Vorteile. Während ein Photometer nur eine Probe aufnehmen kann, analysiert ein Mikroplatten-Reader knapp 100 Proben innerhalb weniger Minuten und benötigt deutlich geringere Probenvolumina. Sogenannte Nanoquant-Platten mit speziell entwickelter Quartzoptik ermöglichen zudem Analysen mit lediglich 2 µL Probenvolumen, was NanoDrop-Anwendungen ermöglicht.

So funktioniert’s

Das Messsystem eines Mikroplatten-Readers entspricht dem eines üblichen Photometers. (2) Das einfallende Licht einer Lichtquelle wird zunächst gebündelt und in die Wells der Mikroplatte fokussiert. Das Lesegerät misst die Intensität des Lichtes, das durch die Probe transmittiert (Absorption) bzw. emittiert (Fluoreszenz) wird. Anschließend wird das Lichtsignal in ein elektrisches Signal umgewandelt und quantifiziert. Für die Analyse werden die Proben in die Wells einer Mikrotiterplatte pipettiert. Eine gängige Platte besteht aus 96 Wells, es sind jedoch auch Platten mit bis zu 384 Wells im Handel. Das System verfügt über mehrere Detektionsmodi (z.B. Fluoreszenzintensität, Absorption). Welcher Detektionsmodus eingesetzt wird, hängt von der Art des verwendeten Assays ab. Neben dem Detektionsmodus weisen die Assay-Kits Unterschiede in ihrer Sensitivität und Kompatibilität mit in der Probelösung enthaltenen Reagenzien (z.B. Puffersalzen, DTT) auf.

Vielfältige Anwendungen

Die Proteinquantifizierung ist ein wichtiger Schritt vor einer chromatographischen oder elektrophoretischen Analyse. Mittels Mikroplatten-Reader lassen sich schnelle und genaue Quantifizierungen im Hochdurchsatz durchführen. (3) In UV-basierten Assays wird den Proben ein Farbstoff-haltiges Reagenz zugesetzt, das mit den Proteinen interagiert. Dies führt zu einer Farbveränderung, die direkt proportional zur Konzentration ist. Dieses Prinzip wird z.B. beim Detergent Compatible Bradford Assay genutzt (Abbildung 1). (4,5) Mithilfe dieses Assays können Proteine schnell (Inkubationszeit: 10 Minuten) und ohne aufwändige Probenvorbereitung analysiert werden. (6) Außerdem ist der Assay mit einer Vielzahl an Detergenzien und Lysereagenzien kompatibel, die zur Herstellung biologischer Produkte häufig eingesetzt werden. Lediglich 10 µL Probenvolumen werden für die Analyse benötigt. Allerdings zeigt der Assay eine hohe Protein-zu-Protein Signalvariabilität, sowie eine mit der Zeit zunehmende Proteinpräzipitation.

Abbildung 1: Quantitative Analyse von Rinderserumalbumin (BSA) unter Verwendung des Detergent Compatible Bradford Assay Kits. Es wurden BSA-Konzentrationen zwischen 0 und 2000 µg/mL gemessen. Die Absorptionsmessungen wurden mit einem Tecan Infinite® M Nano+ Mikroplatten-Reader bei 595 nm durchgeführt. Für die Kurvenanpassung wurde ein Vier-Parameter-Marquardt-Fit verwendet.

Beim Fluoreszenz-basierten NanoOrange® Protein Quantification Assay werden Reagenzien eingesetzt, die in wässrigen Lösungen praktisch nicht fluoreszieren und erst nach Interaktion mit den Proteinen eine Fluoreszenzsteigerung erfahren. Im Vergleich zum Bradford-Assay weist dieser Assay eine deutlich niedrigere Signalvariabilität auf (Abbildung 2). Der NanoOrange® Assay ist mit einem Detektionsbereich von 10 ng/mL- 10 µg/mL sensitiver und wird nicht durch in der Probelösung vorhandene Nukleinsäuren beeinflusst. Basierend auf den chemisch stabileren Reagenzien ist eine Messung bis zu 6 Stunden nach der Probeaufarbeitung möglich.

Abbildung 2: Quantitative Analyse von Rinderserumalbumin (BSA) unter Verwendung des NanoOrange® Protein Quantification Kits. Es wurden BSA-Konzentrationen zwischen 0,06 und 10 µg/mL gemessen. Die Fluoreszenzmessungen wurden mit einem Tecan Infinite M Nano+ Mikroplatten-Reader bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 485/590 nm durchgeführt. Für die Kurvenanpassung wurde ein Vier-Parameter-Marquardt-Fit verwendet.

Neben Proteinen können auch Nukleinsäuren mittels Assays in Mikrotiterplatten quantifiziert werden. Dies reduziert Zeit und Kosten in Downstream-Experimenten (PCR, Transkription, reverse Transkription, Northern Blot Analyse) und gibt Aufschluss über den Aufreinigungserfolg eines Biopharmazeutikums. (3) Als optische Techniken werden auch hier die UV-Vis- und Fluoreszenzmessung eingesetzt. Als Beispiele sind die Invitrogen Quant-iT Assay-Kits von Thermo Fisher Scientific zu nennen. Diese Assays nutzen Fluorophore, die an DNA/RNA binden und einen Komplex bilden. Die Fluoreszenzintensität ist dabei proportional zur Menge des Zielmoleküls in der Probe.

Ein weiteres Anwendungsgebiet sind Enyzme-linked immunosorbent assays (ELISA). (3) Das Prinzip dieser Assays beruht auf der Bindung des Analyten über Antigen-spezifische Antikörper und seiner anschließenden Markierung durch einen enzymgebundenen Antikörper. Das Enzym wandelt ein Substrat in ein z.B. chromogenes oder fluorogenes Produkt um, welches vom Mikroplatten-Reader nachgewiesen werden kann. Dabei korreliert das Signal mit der Menge des in der Probe vorhandenen Analyten. ELISA ist eine unverzichtbare Methode in den Biowissenschaften für die quantitative Analyse von spezifischen Peptiden, Proteinen, Antikörper und Hormonen (z.B. Cytokine, Phosphoproteine, Onkogene, Biomarker).

Mehr Flexibilität für Ihre Biopharmazeutika

Mikroplatten-Reader bieten Flexibilität und hohe Sensitivität für die Analyse Ihrer biopharmazeutischen Produkte. Basierend auf den zahlreichen Detektionsmodi und Analyse-Kits lassen sich die perfekt auf Ihr Produkt abgestimmten Assays finden und damit zuverlässige Ergebnisse erzielen

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1. Courcol, R.J. et al. (1983): “Automated reading of a microtiter plate: preliminary evaluation in antimicrobial susceptibility tests and Enterobacteriaceae identification”
2. Tecan (2016): “Instructions for Use for Infinite 200 Pro”
3. Thermo Fisher Scientific (2022): “Guide to microplate readers- a one-stop solution for your microplate detection needs”, https://www.google.com/url?sa=t&source=web&rct=j&opi=89978449&url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/BID/brochures/guide-microplate-readers.pdf&ved=2ahUKEwiql8SA7NqFAxVl_7sIHSygASEQFnoECBgQAQ&usg=AOvVaw3THPD4IXck8EDCBt1HxHId
4. Molecular Probes (2008): “NanoOrange Protein Quantitation Kit Protocol”, https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fmp06666.pdf
5. Thermo Fisher Scientific (2016): “Pierce Detergent Compatible Bradford Assay Kit Protocol”, https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2F23246_23246S_deter_compat_bradford_UG.pdf
6. Life Technologies (2010): The Molecular Probes Handbook- A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11^th Edition, https://www.thermofisher.com/de/de/home/references/molecular-probes-the-handbook/protein-detection-and-proteomics-technology/quantitation-and-selective-purification-of-proteins-in-solution.html)