Charged-Aerosol-Detektion in der pharmazeutischen Analytik

Charged-Aerosol-Detektion (CAD): Prinzipien, Stärken und Anwendungen

In den letzten Jahren hat sich der Charged-Aerosol-Detektor (CAD) als Standard für die quantitative Analyse nicht-chromophorer Substanzen etabliert. Er ist ein universeller HPLC-Detektor, der semi- und nichtflüchtige Verbindungen präzise detektieren kann und sich besonders für Moleküle ohne oder mit nur einer begrenzten Anzahl von Chromophoren eignet.

Die pharmazeutische Analytik erfordert Geräte mit hoher Empfindlichkeit, Zuverlässigkeit und Vielseitigkeit. Viele Wirkstoffe, Hilfsstoffe und Verunreinigungen weisen keine oder nur eine begrenzte Anzahl chromophorer Gruppen auf und entziehen sich daher konventionellen optischen Detektionsmethoden wie UV/VIS oder Fluoreszenz. In diesem Zusammenhang hat sich der CAD als praktische und universelle Lösung etabliert, um diese Lücke zu schließen und die quantitative Bestimmung semi- und nichtflüchtiger Analyten ohne Derivatisierung zu ermöglichen. Daher ist er sowohl bei der Entwicklung neuer Medikamente als auch bei der Qualitätskontrolle in regulierten Kontexten ein wertvolles Instrument.

1. Funktionsprinzip und Betriebsparameter des CAD

Bei dem CAD wird das Eluent aus der Säule in mikrometergroße Tröpfchen zerstäubt. Größere Tröpfchen werden durch einen Hochleistungs-Gasstrom entfernt, während die verbleibenden in ein beheiztes Trockenrohr gelangen, wo das Lösungsmittel verdampft. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels bleiben die nichtflüchtigen Analytmoleküle als winzige feste Partikel zurück, die im Detektor mit positiv geladenem Stickstoff aufgeladen werden, sodass ihre elektrische Ladung gemessen werden kann. Das gemessene Signal ist konzentrationsproportional. Da der Ionisations- und Detektionsprozess durch Partikelgröße, Löslichkeit, Tröpfchenverteilung und Ladungsübertragung beeinflusst wird, ist das CAD-Signal meist nicht linear über den gesamten Konzentrationsbereich. Typischerweise zeigt sich eine Sättigungskurve. Das Signal lässt sich zum Beispiel durch eine logarithmische Darstellung linearisieren.

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung von LC-CAD mit einer umgekehrten Gradientenpumpe, die die Zusammensetzung der mobilen Phase durch Reduzierung von Rauschen und Schwankungen stabilisiert.

Abbildung 1: Schematische Darstellung eines LC-CAD mit einer Sekundärpumpe, die einen inversen Gradienten liefert. (Quelle 1)

Die Empfindlichkeit des Detektors hängt von mehreren Faktoren ab: der Zusammensetzung der mobilen Phase (wichtig für eine stabile Zerstäubung), Matrixeffekten (variabler Salzgehalt oder Puffer) sowie den Zerstäubungs- und Trocknungsbedingungen (Gasfluss, Temperatur). Die umgekehrte Gradientenpumpe verbessert die Stabilität und das Signal-Rausch-Verhältnis zusätzlich.
Unser Modell, Corona VEO RS, arbeitet mit bis zu 2,0 ml/min und ist mit den gängigsten Säulenformaten kompatibel: Von konventionellen 4,6 mm bis hin zu modernen 2,1 mm UHPLC-Säulen, die aufgrund ihrer besseren Leistung bevorzugt werden. Typische Flussraten liegen zwischen 0,2–1,5 ml/min (HPLC/UPLC) und 50–200 µl/min (MicroLC), mit automatischer Anpassung des Zerstäuberdrucks. Die Verdampfungstemperatur (Standard 35 °C) ist je nach mobiler Phase und Konzentration einstellbar.

Niedrigere Temperaturen führen zu einer gleichmäßigeren Detektorantwort, erhöhen jedoch das Grundrauschen durch halbflüchtige Substanzen; höhere Temperaturen verringern zwar dieses Rauschen, können aber labile Analyten beeinträchtigen.

2. Stärken und Grenzen

Der CAD bietet mehrere Vorteile, die ihn von anderen Detektoren unterscheiden. Er ist nahezu universell einsetzbar, da er auch nicht-chromophore und schwach chromophore Verbindungen unabhängig von der chemischen Struktur des Analyten zuverlässig erkennt. Darüber hinaus ist der CAD mit der Gradientenelution kompatibel, was seinen flexiblen Einsatz in modernen HPLC-Methoden ermöglicht. Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit, quantitative Bestimmungen ohne Referenzstandards durchzuführen, da die Signalintensität mit der Analytmasse korreliert. Der CAD ist robust gegenüber den optischen Eigenschaften und den Brechungsindizes der Probe, was ihn zu einem zuverlässigen Detektor in komplexen Matrices macht.

Dennoch sind beim Einsatz von CAD gewisse Einschränkungen zu berücksichtigen. Der CAD erfordert die Nutzung hochreiner flüchtige Additive und Lösungsmittel in der mobilen Phase. Nichtflüchtige Additive sind nicht kompatibel. Flüchtige Substanzen sind schwer oder gar nicht zu erkennen, da sie beim Trocknungsprozess verloren gehen. Die Empfindlichkeit hängt stark von der Zusammensetzung der mobilen Phase ab, insbesondere vom Anteil organischer Lösungsmittel. CAD weist zudem keine perfekte Linearität über sehr weite Konzentrationsbereiche auf, sodass logarithmische Transformationen zur Datenaufbereitung notwendig sein können. Der Wartungsaufwand ist ebenfalls etwas höher, und die Anschaffungskosten sind relativ hoch. Ein weiterer Nachteil ist die Signalverzögerung durch das Totvolumen des Detektors.

3. Vergleich mit anderen Detektortypen

Zu den klassischen HPLC-Detektoren gehören der Brechungsindexdetektor (RID), der Verdampfungslichtstreudetektor (ELSD) und der Stickstoff-Chemilumineszenzdetektor (CLND).
Diese Detektoren gelten deshalb als quasi-universell, weil sie unabhängig vom Vorhandensein spezifischer Chromophore ein Signal für eine Vielzahl von Substanzen liefern. Jeder weist jedoch spezifische Einschränkungen auf: Der ELSD bietet eine eingeschränkte Reproduzierbarkeit und ein nichtlineares Ansprechverhalten; der RID ist einfach zu handhaben, besitzt jedoch eine geringe Empfindlichkeit und ist nicht mit Gradientenelution kompatibel. Der CLND wiederum ist sehr empfindlich und stickstoffselektiv (quasi-universell innerhalb der Klasse der stickstoffhaltigen Verbindungen). Er detektiert ausschließlich stickstoffhaltige Analyten, und die mobilen Phasen sowie Puffer dürfen keine zusätzlichen Stickstoffquellen enthalten. Der Betrieb erfordert einen technischen Aufwand, insbesondere regelmäßige Wartung, eine zuverlässige Gasversorgung sowie periodische Kalibrierungen.

Die meisten HPLC-Detektoren basieren auf der Erfassung von Chromophoren. Der UV/VIS-Detektor ist der am weitesten verbreitete Vertreter und erkennt zuverlässig nur Verbindungen mit geeigneten, absorbierenden Chromophoren. Nicht-chromophore Substanzen bleiben in der Regel unsichtbar, sofern sie nicht chemisch derivatisiert werden. Der CAD überwindet diese Einschränkung, da er auch nicht-chromophore oder schwach chromophore Substanzen zuverlässig detektiert.

Im Vergleich zu ELSD, RID und Fluoreszenzdetektoren bietet der CAD mehrere Vorteile. Er zeigt ein gleichmäßigeres und lineareres Ansprechverhalten als der ELSD, ist empfindlicher und flexibler als der RID und deckt ein deutlich breiteres Substanzspektrum ab als Fluoreszenzdetektoren, die ausschließlich für fluoreszierende oder markierte Moleküle geeignet sind. Seine Empfindlichkeit übertrifft die des RID und ist mit jener des UV/VIS-Detektors vergleichbar, bleibt jedoch der des Fluoreszenzdetektors unterlegen.

Die Universalität des CAD beruht darauf, dass er nahezu jede Substanz detektiert, die in Partikel überführbar ist. Verbindungen mit einem Siedepunkt über 400 °C, einer Verdampfungsenthalpie über 65 kJ/mol und einem Molekulargewicht über 350 g/mol gelten in der Regel als nichtflüchtig und werden entsprechend zuverlässig erkannt. Für die Analyse komplexer Proben ist jedoch häufig die Kombination mehrerer Detektoren erforderlich. Während UV/VIS-Detektoren die präzise Quantifizierung chromophorer Moleküle ermöglichen, eignet sich der CAD ideal als Sekundärdetektor, um ein möglichst breites Substanzspektrum abzudecken.

4. Wofür wir der CAD verwendet?

Der CAD wird insbesondere dann eingesetzt, wenn UV/VIS-Detektoren ungeeignet sind. Er wird häufig in Kombination mit chromatographischen Techniken wie SEC-CAD und HILIC-CAD in der pharmazeutischen Analytik verwendet. SEC-CAD ermöglicht die Charakterisierung von komplexen Biomolekülen wie Polymere, Proteinen und damit die Überwachung von deren Reinheit, Größe und das Vorhandensein von Aggregaten. Diese zählen zu wichtigen Qualitätsattributen von pharmazeutischen Produkten, HILIC-CAD hingegen ermöglicht den empfindlichen Nachweis kleiner polarer Moleküle – Kohlenhydrate, Oligosaccharide, Glykane und Aminosäuren – ohne Derivatisierung und ist somit nützlich für die Beurteilung der Zusammensetzung und Sicherheit therapeutischer Proteine und Hilfsstoffe. In beiden Konfigurationen ermöglicht CAD den Nachweis chromophorfreier Substanzen und erlaubt so eine Überwachung von Verunreinigungen, Abbauprodukten sowie Begleit-Ionen von Wirk- und Hilfsstoffen (z.B. Chlorid, Natrium, Kalium, Acetat).

Ein wichtiges Anwendungsgebiet ist die Analyse von Polysorbaten und Polyethylenglykolen (PEGs), häufig Hilfsstoffe in biopharmazeutischen Produkten. CAD ermöglicht deren Quantifizierung und Überwachung von Abbauprodukten wie freien Fettsäuren oder kurzkettigen Fragmenten. Es wird auch in der Lipidomik zur Charakterisierung von Phospholipiden, freien Fettsäuren und Glykolipiden eingesetzt und liefert wichtige Informationen für die Formulierungsentwicklung und Stabilitätsstudien. Ein weiteres wichtiges Feld ist die Analyse von Kohlenhydraten und Glykanen in therapeutischen Proteinen und monoklonalen Antikörpern: CAD ermöglicht die Profilierung dieser Moleküle ohne Derivatisierung, was die Analysezeiten verkürzt und die Qualitätskontrolle unterstützt. Schließlich eignet sich CAD für die direkte Quantifizierung von Aminosäuren, die für die korrekte Zusammensetzung und Stabilität therapeutischer Proteine essenziell sind, und ermöglicht die genaue Überwachung sowohl freier Aminosäuren als auch von Abbauprodukten.

Abbildung 2: Anwendung des CAD bei der Untersuchung von Lösungen mit verschiedenen Aminosäuren zur Bewertung der Trenn- und Detektionsleistung.

CAD wird außerdem zum Nachweis von vielen pharmazeutischen Wirkstoffen (APIs), Prozesskontaminanten und Naturprodukten mit schlechten UV-Eigenschaften eingesetzt. Er wird bei Stabilitäts- und Abbaustudien und Quantifizierung von Substanzen verwendet, die mit herkömmlichen Methoden schwer nachweisbar sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CAD dank seiner hohen Empfindlichkeit und der Fähigkeit, nahezu alle nicht- oder halbflüchtigen Komponenten zu erfassen, ein wertvolles und breit einsetzbares Detektionsverfahren in der Pharmazie und Biotechnologie darstellt.

Haben wir ihr Interesse geweckt?
Kontaktieren Sie uns hierzu gerne. Die Experten aus dem Bereich Laboratory Services stehen Ihnen jederzeit für weitere Informationen zur Verfügung. CAD ist eines von vielen Geräten, die zu unserer technischen Ausstattung gehören. Hier geht es zum PDF: Equipment Laboratory Services.

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